這實驗在書上看過
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1.Homogenization
Cells grown in monolayer 單層貼附性細胞
※ 1ml TRIZOL 加入3.5cm培養皿(在培養皿上溶解細胞,吸放使cell均勻,TRIZOL可瓦解細胞、溶解細胞內組成物,但仍可維持RNA完整性)
2.Phase separation
※ sample至於室溫下5分(使nucleoprotein
complex完全分解)
※ + 0.2ml chloroform / 1ml TRIZOL,手搖約15秒
※ 置於室溫下2~3分
※ 4℃下,離心15分(12000xg以下)
※ 離心後呈現三層(下層為紅色有機層(phenol-chloroform)/中間(interphase)白色絲綢狀/上層為無色水層,RNA在水層。DNA、protein會被Cl帶入有機層)
3.RNA precipitation
※ 將水層移至乾淨的試管
※ + 0.5ml isopropyl alcohol / 1ml TRIZOL (使RNA沉澱)
※ 置於室溫10分
※ 4℃下,離心10分(12000xg以下)
※ 離心後,試管底側邊形成膠狀顆粒(pellet)
4.RNA wash
※ 移去離心後上清液
※ 以1ml 75﹪酒精 / 1ml TRIZOL洗RNA pellet一次
※ 手搖均勻(vortex??)
※ 4℃下,離心5分(7500xg以下)
5.Redissolving the
RNA 溶解RNA
※ 使RNA pellet變乾(風乾/真空抽乾5~10分,博班學長用pipette吹氣加速!)
※ 不能完全乾燥(這樣會降低其溶解度)
※ + 2μl buffer
※ + 2μl enzyme(DNase)
※ 37℃下等待30分
※ + DEPC-H2O 180 μl
※ + 3M Na+ 20μl
※ + 100% EtOH 550μl(2.5*220)
※ mix well
※ overnight