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這實驗在書上看過

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1.Homogenization

Cells grown in monolayer 單層貼附性細胞

    1ml TRIZOL 加入3.5cm培養皿(在培養皿上溶解細胞,吸放使cell均勻,TRIZOL可瓦解細胞、溶解細胞內組成物,但仍可維持RNA完整性)

2.Phase separation

    sample至於室溫下5分(使nucleoprotein
complex
完全分解)

    + 0.2ml chloroform / 1ml TRIZOL,手搖約15

    置於室溫下2~3

    4℃下,離心15分(12000xg以下)

    離心後呈現三層(下層為紅色有機層(phenol-chloroform/中間(interphase)白色絲綢狀/上層為無色水層,RNA在水層。DNAprotein會被Cl帶入有機層)

3.RNA precipitation

    將水層移至乾淨的試管

    + 0.5ml isopropyl alcohol / 1ml TRIZOL (使RNA沉澱)

    置於室溫10

    4℃下,離心10分(12000xg以下)

    離心後,試管底側邊形成膠狀顆粒(pellet

4.RNA wash

    移去離心後上清液

    1ml 75﹪酒精 / 1ml TRIZOLRNA pellet一次

    手搖均勻(vortex??

    4℃下,離心5分(7500xg以下)

5.Redissolving the
RNA
溶解RNA

    使RNA pellet變乾(風乾/真空抽乾5~10分,博班學長用pipette吹氣加速!)

    不能完全乾燥(這樣會降低其溶解度)

    + 2μl buffer

    + 2μl enzymeDNase

    37℃下等待30

    + DEPC-H2O 180 μl

    + 3M Na+  20μl

    + 100% EtOH 550μl2.5*220

    mix well

    overnight


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